NGS实验室建设原则及经验分享！

  高通量测序技术又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。因其高通量、不依赖于已知核酸序列和具有更高的灵敏度，从最初未知β属冠状病毒的快速鉴定到病毒序列的完整破译，再到病毒序列的变异监测，高通量测序技术在疫情防控工作中发挥了很重要的作用。

  于中山医科大学取得医学本科和病理硕士学位，德国慕尼黑科技大学取得医学博士学位，在纽约医学院和纽约州立大学完成博士后训练

  曾分别任广州医学院附一院病理医师、Texas A&M University毒理与肿瘤实验室Scientist和纽约州立大学肿瘤预防研究所副教授

  欧阳能太教授：NGS技术是精准医学领域中一项最重要的技术。精准诊断离不开分子诊断，而NGS技术是其中最难亦是应用最广的一项分子诊断技术。NGS技术相对来说还是比较复杂，需要一整套的系统工程才能完成，其中NGS实验室的建设最重要，也有可能会出现问题。

  NGS实验室的建设原则可参考我们这一领域的大咖李金明教授提出的一个原则，其称之为“16字方针”，即各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作。前两个原则涉及如何设置，后两个原则则提醒注意别走过头，应根据医院的真实的情况，注意工作的方便，不拘泥于标准。这也是我提示警醒我们需要非常注意的第一点。目前各个医院对NGS技术的支持力度很大，但在建设NGS实验室时需注意总体面积不宜过大，以免能耗消耗非常大。此外，在实验室各区比例的设置上不要求平均比例，有的环节很小即可，有的环节可相对较大一些，即比例要合适。随着医院对NGS实验室的支持力度越大，要求也越为严格，但有些医院也出现走极端的情况，即分区非常多，房间数很多，但实际并不方便工作。应注意类似步骤的合并，设置适当的房间数。

  第二点，需注意风向。其一，NGS实验室应使用全新风系统，而不可以使用普通家用空调。新风系统可排出污染，而这是防污染最基础的设置。其二，需注意整个房间的气流方向应形成对流才有效。其三，目前出现一些明显的异常问题较大的是生物安全柜、通风柜和超净工作台这三种设备的合理配置使用。对于样本的处理，需使用生物安全柜。生物安全柜通常使用A2级，不要太高级，30%外排即可满足基本需求。B2级过高，100%外排，其实并不是很合适。超净工作台除了在试剂准备间中能够正常的使用外，另外的地方不适宜使用。在所有环节中均使用超净工作台是不对的，因为超净工作台没有外排功能，如果DNA气溶胶一直在室内循环是不合适的。而有的单位为了重视起见，所有环节，包括文库构建都使用生物安全柜，实际上也没有必要。除了样本处理间，另外的地方使用通风柜即可。相关需要注意的几点很多，在此不一一赘述。

  欧阳能太教授：NGS技术是一项系统工程，质量控制很重要，主要的质控点有三个。第一个便是肿瘤样本的质控。在实际在做的工作中有时会出现搞错样本的情况，或是前期诊断的失误等。例如，对肺腺癌进行EGFR检测，但如果拿到的是小细胞肺癌的样本，则通常不做。其次，对样本中癌细胞的数量要进行质控。细胞数量太少，可能没办法测出。虽说NGS灵敏度比较高，但仍有检测下限。而癌细胞占比也很重要，如果癌细胞占比很小，而其他细胞占比很大，也会影响检验测试灵敏度，此时有必要进行富集。概而言之，即在肿瘤样本的质控上需注意肿瘤类型、癌细胞总体数量和占比。

  第二个质控点是文库构建。文库构建是一个中间环节，即上机之前样本是否准备妥当。主要涉及浓度和片段大小是不是满足要求。浓度，一般使用Qubit测浓度即可；片段大小，通常用Agilent 2100做质控。

  第三个质控点是数据，即测序后下机的数据是否符合标准要求。因为前两个步骤可能没有发现问题，但最后测序却不行。这其中涉及很多方面，包括测序仪本身运行是不是正常等。数据质控是最后一个质控点，如果上述均无问题，则可进行后续的临床分析和解读。

  欧阳能太教授：NGS技术很强大，也是一项非常好的技术，其应用于临床也才刚刚起步，目前还有很多大医院都没有开展。我相信在未来NGS技术的应用不论是使用的范围，还是使用的深度都将有很大的发展。

  高通量测序检测实验室也叫NGS实验室，是以高通量测序技术为检验测试手段，来完成临床疾病筛查、诊断或辅助诊断、肿瘤基因突变检测等项目。

  由于NGS技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，有可能会出现实验室污染导致检测结果不准确；且NGS实验要求高、影响因素多，实验过程处理不当也会导致检测结果异常。因此一个严格有序、规范的NGS实验室是非常必要的。

  目前高通量测序技术在临床检测上的应用愈来愈普遍，今天给大家粗略地介绍一下NGS实验室的建设和合理分区。

  高通量测序技术又称NGS (Next Generation Sequencing)技术，它是对传统Sanger测序技术（即一代测序技术）进行了革命性的升级，可同时对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定，使得转录组学和基因组学被大范围的应用于临床疾病诊疗实践中，预示着疾病诊疗分子时代的到来。

  高通量测序检测实验室也叫NGS实验室，是以高通量测序技术为检验测试手段，来完成临床疾病筛查、诊断或辅助诊断、肿瘤基因突变检测等项目。高通量测序实验包括湿桌实验过程和干桌实验过程，其中湿桌实验是指实验标本预处理、核酸提取及其片段化、建库、扩增、靶序列富集、混样、测序前准备及测序，干桌实验是指测序后的数据分析、对比、注释和结果报告等生物信息学分析流程。

  由于NGS技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，有可能会出现实验室污染导致检测结果不准确；且NGS实验要求高、影响因素多，实验过程处理不当也会导致检测结果异常。因此一个严格有序、规范的NGS实验室是非常必要的。

  实验室各个区域无论是在物理空间上还是实际使用的过程中，都应当处于完全分隔状态，并且各区域之间不能有空气的直接流通。

  NGS检测通常涉及PCR扩增及核酸纯化富集等过程，任何样本源性污染、分析标签源性污染、扩增产物污染或气溶胶污染均可能会引起假阳性或假阴性结果出现，因此各实验区域与缓冲间应有一定的通风压力差，保证合理的空气流向，防止污染。

  新建实验室除合理规范外，也要易于管理；若原有实验室通过合理的规划改造也能满足质量管理要求，亦可不必特地新建实验室。

  实验室区域选择及空间设计还应最大限度考虑是不是方便日常监测工作，包括方便人员流动效率、大型仪器设施进出落地等。

  本区域为洁净区域，用于试剂的配制、分装及少量储藏等，需存放于此区域的试剂不可逆行由后续处理样本的区域进入。另外，试剂盒中的阳性质控品和对照品不应贮存于此区域。

  本区域为半污染区，用于核酸的提取及浓度测定。在提取不一样的样本（新鲜组织、FFPE、血液等）核酸时应避免样本之间的交叉污染，建议在区域内设置不一样样本的独立的超净工作台。布局时应注意高速离心机运行时产生的振动是否干扰其它设备等细节。

  仪器设备：冰箱、生物安全柜、核酸自动提取仪、高速离心机、水浴锅、恒温金属浴、核酸定量仪、冰箱、移液器、涡旋振荡器和磁力架。

  本区域为半污染区，用于文库的构建。NGS检测时常见的文库制备方法有杂交捕获法和扩增子法，两种方法均包含通过PCR放大文库产量的步骤，因此在文库制备区构建文库时，建议文库扩增产物传递至下一阶段区域（杂交捕获区）进行纯化及后续操作。另外，组织样本做捕获法建库时需要先对样本做片段化处理，因此操作台面规划时应区分片段化区域和建库区域。

  仪器设备：冰箱、生物安全柜、普通PCR仪、核酸定量仪、磁力架、超声打断仪、移液器、涡旋振荡器和离心机。

  本区域为半污染区，用于文库扩增后的纯化，以及后续的二次扩增或捕获富集等步骤。严防此区域扩增产物及气溶胶等对其它区域的污染，最好能够降低人员在该区域与其它区域之间反复频繁流动，同时该区域的实验物品、实验服等尽可能的避免外带。

  仪器设备：普通PCR仪、核酸定量仪、磁力架、金属浴、真空浓缩仪、移液器、涡旋振荡器和微型离心机。

  本区域为半污染区，对杂交捕获产物进行PCR扩增富集，同时对上机测序前的文库进行质控，并且完成文库上机前文库最终的稀释和混样。

  仪器设备：冰箱、普通PCR仪、核酸定量仪、磁力架、移液器、涡旋振荡器和微型离心机。

  本区域为半污染区，用于文库的上机测序。此区域应配备稳定的供电设施及备用电源，并配备独立的制冷设施保证测序仪在相对恒定的温湿度环境下工作；还需开设适宜面积的机房用于放置服务器等，所配备的网关设备应兼具稳定性和安全性，确保数据有效、安全传输。

  仪器设备：冰箱、凝胶电泳、生物片段分析仪、移液器、涡旋振荡器和微型离心机。

  总之，一个规范的NGS检测实验室是获得准确检测结果的重要保障，在实验室运行过程中要从始至终坚持“工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时”的基本准则。

  [1]李金明.高通量测序技术[M].第1版.北京:科学出版社,2018.